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LA DYSTROPHINE |
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La Dystrophine, un mastodonte très agile !
Une collaboration pluridisciplinaire entre quatre équipes de recherche britanniques et françaises a permis d’observer pour la première fois, au sein du muscle vivant et en temps réel, les mouvements de la protéine Dystrophine dont le défaut est impliqué dans certaines myopathies. La révélation d’une mobilité inattendue de la protéine pose les bases expérimentales nécessaires à l’étude in vivo des formes alternatives de Dystrophine pouvant servir à d’éventuelles thérapies géniques. Cette étude est publiée dans la revue eLIFE.
Les dystrophies musculaires liées à l’absence de Dystrophine, dont les myopathies de Duchenne et de Becker, sont pour le moment incurables et certaines sont létales. La thérapie génique pour traiter les patients atteints de dystrophie musculaire fait l’objet d’efforts internationaux intenses. Cependant, les résultats sont mitigés car la taille extrêmement grande de cette protéine rend techniquement difficile son transfert dans le muscle des patients et des formes plus courtes ont été testées.
Dans le but de mieux comprendre le fonctionnement de la Dystrophine, des chercheurs du King’s College London, de l’University of Surrey, du Laboratoire Biothérapies des Maladies Neuromusculaires à Université de Versailles et du Centre de Biologie du Développement à Toulouse, ont couplé la protéine humaine à un fluorophore avant de l’introduire dans le muscle du poisson-zèbre. Ce modèle biologique a été choisi pour sa transparence permettant ainsi de visualiser la Dystrophine au travail au sein du muscle. Les mouvements de la Dystrophine ont pu être observés grâce au développement d’une nouvelle stratégie d’analyse des données fournies par la technique de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) qui permet de mesurer la diffusion et la liaison des protéines au sein des cellules. La protéine apparait beaucoup plus mobile qu’attendu pour une molécule de cette taille. En effet, Dystrophine, avec son poids de 430 kDa, est un mastodonte que l’on imaginait rester de manière permanente à la membrane des cellules musculaires pour en assurer l’intégrité au cours des cycles de contraction-relaxation. L’observation en temps réel a permis de démontrer que certaines molécules de Dystrophine s’attachent et se détachent rapidement de la membrane des cellules musculaires. Ce résultat inattendu pose de nombreuses questions. Cette dynamique est-elle liée à la fonction structurelle de la Dystrophine ? Traduit-elle une fonction jusque-là insoupçonnée ?
Les informations nouvelles apportées par cette étude sur la physiologie de la Dystrophine permettent d’établir un protocole expérimental pour tester la dynamique des différentes formes courtes de Dystrophine, directement dans les cellules musculaires, avant d’éventuels tests en thérapie génique. Ceci permettra également de mieux comprendre le rôle des différents domaines de la Dystrophine et de leur influence sur sa dynamique au sein des cellules. Il deviendra ainsi possible de mieux saisir le lien entre les différentes mutations connues de la Dystrophine et les divers degrés de sévérité de la maladie observés chez les patients.
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Le pouvoir naturel de réparation des dents élucidé |
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Le pouvoir naturel de réparation des dents élucidé
22 avril 2015
cp_O_Kellerman_20042015 (775,7 ko)
Les chercheurs de l’Inserm et de l’université Paris Descartes viennent de franchir un pas dans la recherche sur les cellules souches et la réparation dentaire. Ils sont parvenus à isoler des lignées de cellules souches dentaires et à décrire le mécanisme naturel par lequel elles parviennent à réparer des lésions de la dent. Cette découverte fondamentale permettra d’initier des stratégies thérapeutiques inédites mobilisant les cellules souches résidentes de la dent afin d’amplifier leur pouvoir naturel de réparation.
© Inserm, D. Chappard
Modélisation 3D d’une dent.La pulpe dentaire est en jaune.
Les résultats sont publiés dans la revue Stem Cells.
La dent est un organe minéralisé, implanté dans la bouche par une racine. La partie "vivante" de la dent ou cavité dentaire, est constituée de la pulpe dentaire (en jaune sur la photo ci-contre) composée de vaisseaux et de nerfs. Autour, on retrouve une substance dure, la dentine ou ivoire, elle-même recouverte d’un tissu encore plus dur, l’email. Lorsqu’une lésion dentaire apparaît, les cellules souches dormantes de la pulpe se réveillent pour tenter de réparer la dent sans que l’on en connaisse le processus.
Dans cette étude, les chercheurs de l’Inserm et de l’université Paris Descartes au sein de l’Unité 1124 "Toxicologie, pharmacologie et signalisation cellulaire" sont parvenus à extraire et isoler, en travaillant sur la pulpe de molaire de souris, des cellules souches de dent.
Dès lors, les chercheurs ont pu analyser finement les cellules et identifier à leur surface 5 récepteurs spécifiques à la dopamine et à la sérotonine, deux neurotransmetteurs essentiels à l’organisme (cf. schéma page 2).
La présence de ces récepteurs à la surface de ces cellules souches indiquait qu’elles avaient la compétence de répondre à la présence de dopamine et sérotonine en cas de lésion. Les chercheurs se sont naturellement demandé quelles cellules pourraient être la source de ces neurotransmetteurs, signaux d’alarme. Il s’avère que les plaquettes sanguines, activées par la lésion dentaire, sont responsables de la libération d’une grande quantité de sérotonine et de dopamine. Ces neurotransmetteurs libérés recrutent alors les cellules souches pour réparer la dent en se fixant à leurs récepteurs (Cf. schéma page 2).
L’équipe de recherche a pu confirmer ce résultat en observant une absence de réparation dentaire chez les rats dont les plaquettes modifiées ne produisent pas de sérotonine ni de dopamine, c’est à dire en l’absence de signal.
"Dans la recherche sur les cellules souches, il est rare de pouvoir à la fois isoler des lignées de cellules, d’identifier les marqueurs permettant de les reconnaitre – ici les 5 récepteurs-, de découvrir le signal qui les recrute – la sérotonine et la dopamine -, et la source de ce signal – les plaquettes sanguines. Dans ce travail, nous avons pu, de manière inattendue, explorer l’ensemble du mécanisme." explique Odile Kellermann, responsable de l’équipe de l’Inserm et de l’Université Paris Descartes, principale auteure de ces travaux
© Inserm, O. Kellermann, A. Baudry
Pour aller plus loin, les chercheurs ont tenté de caractériser les différents récepteurs mis en évidence. Un des 5 récepteurs ne semble pas impacter le processus de réparation. Au contraire, les 4 autres se révèlent très impliqués dans le processus de réparation. Le blocage in vivo d’un seul d’entre eux suffit pour empêcher la réparation dentaire.
"Actuellement, les dentistes utilisent des matériaux de coiffage (hydroxyde de calcium) et des biomatériaux à base de phosphate tricalciques pour réparer la dent et combler les lésions.Nos résultats permettent d’envisager des stratégies thérapeutiques inédites qui viseraient à mobiliser les cellules souches résidentes de la pulpe afin d’amplifier le pouvoir naturel de réparation des dents sans avoir recours à des matériaux de substitution." conclut Odile Kellermann.
Les bases sont posées pour étendre ces recherches obtenues chez le rongeur aux cellules souches de la dent chez l’homme afin d’initier de nouvelles stratégies de réparation des dents.
En savoir plus
Contact chercheur
Odile Kellermann
Unité Inserm 1124 "Toxicologie, pharmacologie et signalisation cellulaire" (Inserm/Université Paris Descartes)
Responsable de l’équipe Inserm « Cellules souches, signalisation et prions »
Tél. : 01 42 86 20 65
Sources
Essential roles of dopamine and serotonin in tooth repair: functional interplay between odontogenic stem cells and platelets
Anne Baudry1,2*, Aurélie Alleaume-Butaux1,2*, Sasha Dimitrova-Nakov1,2*, Michel Goldberg1,2, Benoît Schneider1,2, Jean-Marie Launay3,4,5** & Odile Kellermann1,2** 1 INSERM UMR-S 1124, Cellules souches, Signalisation et Prions, 75006 Paris, France. 2 Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, UMR-S 1124, 75006 Paris, France. 3 AP-HP, Service de Biochimie, Hôpital Lariboisière, 75010 Paris, France 4 INSERM U942, Hôpital Lariboisière, 75010 Paris, France 5 Pharma Research Department, F. Hoffmann-La-Roche Ltd., CH-4070 Basel, Switzerland Stem Cells, 7 avril 2015 Doi: 10.1002/stem.2037
Contact presse
Juliette Hardy
Tél. : 01 44 23 60 98
DOCUMENT inserm.fr LIEN
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La communication cellulaire mise en lumière |
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La communication cellulaire mise en lumière
Jean-Pierre Henry dans mensuel 340
daté mars 2001 - 
Nos cellules commandent nos mouvements et nos émotions en échangeant des informations sous forme de molécules. Les biologistes comprennent assez bien la réception de ces informations, mais de nombreuses questions subsistent quant aux mécanismes d'émission des molécules. Des méthodes physiques permettent des observations plus précises de ce phénomène.
Le vase en cristal est sur le point de tomber. D'un coup d'oeil, vous évaluez sa trajectoire, et vous le rattrapez juste avant qu'il ne se brise, d'un mouvement rapide et précis. Ce geste, apparemment simple, résulte de la transmission d'une multitude d'informations entre les cellules spécialisées du système nerveux, les neurones. Ceux-ci échangent des informations dans des zones de contact spécialisées, les synapses : un neurone y libère des molécules, appelées neurotransmetteurs, que l'autre détecte. Ces transmissions sont rapides, et peuvent se répéter à haute fréquence sur une même synapse.
La communication entre cellules peut également s'effectuer plus lentement, mais à plus longue distance, grâce aux hormones. C'est notamment le cas de la décharge d'adrénaline : des hormones libérées dans le sang sont détectées par des récepteurs dispersés, loin de l'émetteur.
Outils et utilisation. Comment les neurotransmetteurs et les hormones sont-ils émis par les cellu-les ? L'importance de cette ques- tion tient, en particulier, aux liens possibles entre des dysfonctionne-ments des processus de sécrétion et des troubles neurologiques. Aujourd'hui, les physiciens proposent de leur prêter main-forte : tandis que les biologistes manipulent des protéines et observent le phénomène de sécrétion dans son ensemble, des méthodes physico- chimiques permettent d'en décrire les étapes, à l'échelle de chaque cellule. Quand le biologiste découvre de quels outils dispose la cellule, le physicien précise comment la cellule les utilise.
A l'intérieur d'une cellule émettrice, les molécules de neurotransmetteur sont contenues dans des vésicules, qui s'approchent de la membrane cellulaire. Lorsque la sécrétion est déclenchée, la membrane d'une vésicule fusionne avec la membrane cellulaire, créant un pore par lequel des molécules de neurotransmetteur sont émises. Ensuite, le comportement des vésicules est variable : certaines s'ouvrent complètement, et s'intègrent à la membrane cellulaire, tandis que d'autres se referment. Pourquoi de telles différences ?
L'équipe de Christian Amatorei, à l'Ecole normale supérieure, en collaboration avec l'équipe de Mark Wightman, à l'université de Caroline du Nord, se consacre depuis plusieurs années à l'étude de la sécrétion1, utilisant comme système modèle des cellules chromaffines, responsables de la sécrétion d'adrénaline par la glande surrénale*. Chaque cellule chromaffine contient 10 000 à 30 000 vésicules, renfermant chacune 3 à 5 millions de molécules d'adrénaline. Ces vésicules sont assez grosses pour que leurs émissions, déclenchées par des injections de nicotine dans la solution où baignent les cellules, soient détectables. Une microélectrode, formée d'une fibre de carbone de quelques micromètres de diamètre enrobée de verre, est placée au voisinage d'une cellule et transmet le courant électrique produit par l'oxydation des molécules d'adrénaline à sa surface.
Ouverture suivie. Le suivi du courant au cours du temps révèle l'évolution de la quantité de molécules relâchées par chaque vésicule. Lorsque l'une d'elles s'ouvre vers l'extérieur, le courant augmente d'abord faiblement : un peu d'adrénaline diffuse à travers le pore. Puis le courant augmente brusquement : le pore s'ouvre rapidement sous l'effet du gonflement du contenu de la vésicule. Cette dernière disparaît alors, par fusion totale de sa membrane avec celle de la cellule.
En étudiant la forme de l'augmentation brusque de courant2, C. Amatore et ses collègues obtiennent des informations sur les forces qui tendent à refermer le pore et celles qui tendent à l'ouvrir, provenant de la très forte courbure des deux membranes au niveau de leur jonction. Un équilibre peut durer plusieurs secondes, et ses fluctuations peuvent donner lieu à des successions de fermetures et d'ouvertures du pore. Au contact du milieu baignant les cellules, le gel contenu dans les vésicules gonfle, entraînant la rupture de cet équilibre. Le pore devient instable et sa taille augmente rapidement, démarrant ainsi la brusque expansion et la fusion totale.
La modélisation des observations indique que, pour gonfler jusqu'à atteindre le point d'instabilité, une vésicule doit atteindre 50 nanomètres de diamètre et relâcher environ 20 000 molécules de neurotransmetteur. Avec les cellules chromaffines, on est dans ce cas. En revanche, pour les neurones, dont les vésicules ont 50 nanomètres de diamètre au maximum, on ne devrait pas observer la fusion totale. Cette prédiction rejoint une hypothèse déjà avancée par certains neurobiologistes, qui décrivaient ce mode de sécrétion par la formule « kiss and run » que l'on pourrait traduire familièrement par « embrasse et tire-toi ».
Parallèlement à cette méthode électrochimique qui permet d'analyser ce qui se passe après l'ouverture du pore, une méthode d'observation optique des étapes précédentes a été mise au point depuis quelques années, notamment par W. Almers, de l'université de l'Oregon : la microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente3.
Une onde lumineuse, dite évanescente* ne pénètre un milieu que sur une courte distance. La « myopie » de ce système le rend intéressant pour observer le voisinage d'une interface. Si des cellules sécrétrices sont placées sur l'interface et si l'on a rendu fluorescentes les vésicules, on observe au microscope le comportement individuel des vésicules présentes dans une « tranche » de cellule d'une épaisseur de 3 ou 4 vésicules.
Par cette technique, W. Almers et ses collègues ont observé le mouvement individuel des vésicules s'approchant de la membrane cellulaire et leur immobilisation à son contact. Lorsque la sécrétion est déclenchée, l'émission a lieu à partir des vésicules immobilisées. Ainsi, les deux approches, élec- trochimique et optique, permettent-elles de suivre l'ensemble des étapes de la sécrétion au niveau d'une vésicule. L'intérêt de la méthode optique est de mettre en évidence les étapes qui précèdent la fusion membranaire, révélées par l'arrimage des vésicules à la membrane cellulaire. Leur description rejoint les préoccupations des biologistes, qui analysent les interactions entre les protéines vésiculaires et cellulaires.
Récemment, W. Almers et ses collègues ont aussi réussi, par cette méthode, à filmer en temps réel les mouvements des vésicules dans un neurone4. Ils ont ainsi confirmé que certaines vésicules sont maintenues en réserve à environ 20 nanomètres de la paroi cellulaire, et que ce stock est remplacé au fur et à mesure de sa disparition.
Des approches physiques, microscopie à onde évanescente et électrochimie, apportent des infor- mations spectaculaires pour comprendre la sécrétion. Cette coopération entre la physique et la biologie n'est aujourd'hui plus isolée. En fait, l'intérêt que les physiciens portent à l'étude de la matière molle et les progrès réalisés par les biologistes, principalement dans l'étude de la cellule, rapprochent ces deux communautés. La biologie fournit aux physiciens de plus en plus de ces objets nanoscopiques comme sujet d'étude, et ce rapprochement entre physiciens et biologistes est un mouvement qui s'amplifie.
1 R.M. Wightman et al. , PNAS , 88 , 10754, 1991.
2 C. Amatore et al. , Angew. Chem. Int. Ed ., 39 , 1952, 2000.
3 J.A. Steyer et al. , Nature , 388 , 474, 1997.
4 D. Zenisek et al. , Nature , 406 , 6798, 2000.
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Affaire Maeso : la biologie au coeur de l'enquête |
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À Valence, en Espagne, un anesthésiste était soupçonné d'avoir contaminé plusieurs centaines de personnes avec le virus de l'hépatite C. L'analyse génétique de ce dernier a permis d'établir les responsabilités du suspect et de le condamner.
En Espagne, plus d'un million de personnes sont porteuses du virus de
l'hépatite C (VHC). Un virus qui se transmet par le sang, même en infime quantité. Les modes d'infection les plus fréquents résultent donc de pratiques à risque : partage de seringues pour la drogue, utilisation de matériel médical non aseptisé, réalisation de piercing ou de tatouage sans stérilisation, rapports sexuels non protégés.
Chez une personne infectée, près de 100 millions de VHC sont produits chaque jour ! Et comme ce virus mute très rapidement, celle-ci devient vite porteuse de nombreuses colonies de virus apparentés mais avec un génome différent.
Dans ce contexte, relier précisément plusieurs centaines de personnes à une même épidémie d'hépatite C est un défi. Notre laboratoire de biologie assermenté auprès du tribunal de Valence a été confronté à ce problème. La justice nous a en effet demandé de l'aide pour identifier les personnes contaminées par un médecin. Pour savoir si un lien biologique existait entre ces personnes, nous nous sommes appuyés sur les techniques de phylogénie moléculaire qui se sont développées récemment en biologie et qui permettent de retracer l'évolution des virus et d'établir leurs liens de parenté.
L'affaire a commencé en 1998. Cette année-là, dans la région de Valence, deux médecins du travail qui exerçaient pour deux sociétés différentes ont constaté, simultanément et indépendamment, plusieurs cas d'hépatite C parmi les salariés qu'ils suivaient. Ce qui les a intrigués, c'est que ces personnes avaient été opérées dans un même hôpital privé de Valence. Ils ont alors alerté les autorités de santé publique.
Celles-ci ont diligenté une enquête. Tous les dossiers d'hépatite C de la région ont été épluchés sur une dizaine d'années. Grâce à ce travail épidémiologique, elles ont découvert que 275 personnes infectées avaient un point commun. Ces personnes avaient toutes été anesthésiées par le même médecin, Juan Maeso, qui exerçait dans cet hôpital privé, ainsi que dans le service de maternité d'un autre établissement public.
Tueur silencieux
En examinant les procédures en vigueur dans les blocs opératoires de l'établissement, les autorités de santé publique ont soupçonné les pratiques du médecin anesthésiste. D'autant plus qu'ils ont découvert que Juan Maeso était porteur de l'hépatite C. Sur la base de ces présomptions, la justice a été saisie. Et l'enquête policière a alors porté sur les rumeurs de toxicomanie de Juan Maeso. Sous-entendu, le médecin s'injectait des drogues employées pour les anesthésies avec la même seringue que pour ses patients.
Au moment où le scandale a éclaté, Juan Maeso avait déjà une longue carrière derrière lui. Beaucoup de personnes avaient été anesthésiées par ce médecin et étaient par conséquent susceptibles d'avoir été infectées. Le danger est que le VHC est un « tueur silencieux ». En effet, au moment de la contamination, il n'entraîne pas de symptômes. Ainsi, les médecins estiment en moyenne que plus d'un tiers des porteurs du virus ignorent qu'ils sont contaminés [2]. Sans le savoir, ils peuvent à leur tour être source de contamination.
En outre, cette ignorance retarde le lancement des traitements. Le virus s'attaque progressivement au foie, conduisant à son inflammation (hépatite) puis au développement de cirrhoses, voire de cancers. D'ailleurs, au moment du scandale, quatre personnes identifiées dans le cadre de l'enquête épidémiologique étaient déjà décédées des complications de leur hépatite.
Face à ce danger de santé publique, les autorités sanitaires et judiciaires ont décidé que toutes les personnes anesthésiées par Juan Maeso devaient faire un test de dépistage. Plusieurs milliers de personnes ont eu alors la mauvaise surprise d'être appelées à se présenter dans des laboratoires d'analyses médicales afin de détecter si elles étaient porteuses du VHC. Au final, 667 personnes ont été déclarées positives.
À ce stade, plusieurs questions essentielles se posaient encore aux enquêteurs : jusqu'où remonter dans le temps à la recherche des patients potentiellement infectés ? De plus, sachant qu'en Espagne, près de 2,5 % de la population est porteuse du virus, comment distinguer les personnes infectées par Juan Maeso des personnes infectées autrement ? D'autant plus que Juan Maeso refusait de reconnaître sa culpabilité.
C'est pourquoi les autorités ont fait appel à notre laboratoire de biologie. Elles nous ont demandé de déterminer s'il y avait un lien « généalogique » entre les virus de l'hépatite C de Juan Maeso et ceux des personnes que le médecin avait anesthésiées. Ce lien constituerait une preuve directe que l'ancêtre commun des virus trouvés dans chaque patient provient bien de Juan Maeso.
Ancêtre commun
Pour mettre en évidence ce lien supposé, nous avons séquencé, analysé et comparé le génome des VHC provenant des 667 échantillons de sérum envoyés à notre laboratoire. Dans le cas du VHC, le génome n'est pas porté par l'acide désoxyribonucléique (ADN) mais par l'acide ribonucléique (ARN). La macromolécule d'ARN est du point de vue de sa structure comparable à un gigantesque collier de nucléotides*.
Pour qu'un virus se réplique dans la cellule qu'il a infectée, il provoque la copie de tout le collier de nucléotides. En général, cette opération est extrêmement fidèle. Néanmoins le nombre de copies - plusieurs millions par jour -, et le nombre de générations sont si gigantesques que des erreurs de copie, c'est-à-dire des mutations, se produisent. En outre, comme l'ARN est chimiquement moins stable que l'ADN, le VHC est un virus qui a d'emblée une forte tendance à muter.
Toutes ces mutations sont comme des marqueurs de l'histoire d'un virus. Si deux virus portent les mêmes mutations, il est probable qu'ils aient eu un ancêtre commun qui les portait. C'est la base de la phylogénie moléculaire. Tout notre travail consiste donc à repérer ces mutations pour constituer des « liens de parenté » entre les virus des échantillons.
Pour y parvenir, nous séquençons les gènes du virus, ce qui revient à lire la succession de nucléotides correspondant à ce gène. Ensuite, nous comparons les séquences en les plaçant les unes au-dessus des autres. Dans la pratique, nous ne séquençons pas la totalité de l'ARN. Toute la subtilité de la phylogénie moléculaire consiste à déterminer les séquences les plus pertinentes pour réaliser les comparaisons entre les échantillons de virus qui permettront de répondre aux questions posées par la justice.
Il faut savoir que les gènes n'évoluent pas tous à la même vitesse. Certains mettent des millions d'années à accepter une mutation, d'autres sont plus tolérants. En général, les séquences de gènes qui évoluent lentement sont utiles pour retracer l'évolution des mutations lointaines. À l'inverse, les séquences de gènes hypervariables nous informent des événements moléculaires plus récents [3].
Dans l'affaire Maeso, nous avons choisi de nous focaliser sur deux fragments du génome du VHC. Le premier fragment correspond au gène qui participe à la réplication de l'ARN viral dans la cellule infectée. Ce fragment est une séquence de 229 nucléotides qui constitue le gène de l'ARN polymérase viral, appelé NS5B. Et il est connu pour évoluer très lentement.
Ainsi, les spécificités de cette séquence permettent aux virologues de classer les VHC en 7 types et 67 sous-types [4]. Les médecins parlent alors de VHC de sous-type 1a, 1b, etc. Le sous-type le plus fréquent en Europe est le VHC 1b. Il s'agit d'une information importante car certains sous-types de VHC réagissent plus ou moins bien aux traitements, et surtout, dans le cadre d'une épidémie, le sous-type du virus source se retrouve chez tous ses descendants.
Le second fragment est une séquence de 406 nucléotides, qui regroupent des gènes E1 et E2. Ceux-ci codent les protéines de l'enveloppe du virus. Ce second fragment comprend trois segments connus comme des régions hypervariables, autrement dit où la probabilité de mutation est beaucoup plus forte que pour le fragment NS5B. En l'occurrence, le séquençage du fragment NS5B nous a aidés à faire un premier tri dans les 667 échantillons de sérums détectés positifs au VHC. Et le second fragment E1-E2 nous a servi à affiner les comparaisons.
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